【Nat Commun】大麦叶锈病抗性基因Rph3编码一种膜蛋白，并被大麦锈菌的无致病型感染后诱导

题目：The barley leaf rust resistance gene Rph3 encodes a predicted membrane protein and is induced upon infection by avirulent pathotypes of Puccinia hordei

刊名：nature communications

作者：Robert F. Park & Mohammad Pourkheirandish et al.

单位：The University of Melbourne, Australia

日期：02 May 2022

01

摘要

由Puccinia hordei引起的叶锈病是一种具有重大经济意义的大麦病害，但仅克隆了几个主要的P. hordei ( Rph ) 抗性基因。在这项研究中， Rph3基因通过定位克隆分离，并通过突变分析和转基因互补得到证实。Rph3基因起源于野生大麦，首先渗入到栽培的埃及种质中，它编码一种独特的预测跨膜抗性蛋白，该蛋白在氨基酸序列水平上不同于所有已知的植物抗病性蛋白。不同种质的遗传概况表明Rph3的遗传多样性有限在驯化种质中，以及来自东地中海地区的野生大麦具有更高的多样性。Rph3基因仅在与Rph3无毒力的P. hordei分离株的相互作用中表达，这种现象也观察到转录激活因子样效应依赖基因，称为执行者，赋予对黄单胞菌属的抗性。与已知的跨膜执行者（如Bs3和Xa7）一样，本塞姆氏烟草中Rph3的异源表达诱导了细胞死亡反应。Rph3的分离强调了不同植物病原体相互作用系统中的趋同进化过程，其中类似的防御机制在单子叶植物和双子叶植物中独立进化。

02

技术路线

Bowman 和 BW746 接种了P. hordei在 2、4 和 8 dpi 收获致病型

感染组织中真菌生物量的量化

表型分析

植物材料和生长条件

DNA分离和标记分析

突变种群的产生、突变筛选

等位基因测试、Rph3结构

使用 Gene Pulser II将质粒 D657-Rph3-oex 引入根癌农杆菌菌株 AGL- 1102 。然后，对大麦 cv. 的未成熟胚进行转化

单体型分析、等位变异、Rph3在不同大麦系列中的频率、启动子分析、蛋白质二级结构预测

03

主要结果

3.1Rph3是一种不完全显性基因，可赋予对P. hordei的抗性

大麦品系 BW746 (Bowman*11/Estate) 与栽培品种 (cv.) Bowman 携带来自地方品种 Estate 的Rph3.c等位基因。该品系理论上包含超过 99% 的受体品种基因组。接种P. hordei致病型 5453 P+ ( AvrRph3 ) 和 200 P- ( AvrRph3 ) 的幼苗表明 cv. Bowman 易感，BW746 对P. hordei致病型 5453 P+ ( AvrRph3 )和 200 P- ( AvrRph3 ) 具有抗性（图 1a）。

通过使用 19,593 个 GBS 标记的基因型数据，在 BW746 中检测到位于染色体 7H 上的来自 Estate 的单个基因渗入片段. 在两个 cv 中，在接种后 2 天 (dpi) 通过显微镜观察真菌感染部位。Bowman 和 BW746 在大小和形态上相似（图 1b）。在 4 dpi 时，真菌菌丝在 cv 中更为丰富。Bowman 与 BW746 相比（图 1b），并且观察到真菌生物量积累的差异（图 1c），尽管两品系之间的宏观症状相似（图 1a与 b）。在 8 dpi 时，cv 中形成了大的菌落。Bowman 和大多数感染部位显示出夏孢子的产生，而感染和生物量积累在 BW746 中受到限制，只有少数感染部位发展出小的 夏孢子（图 1 a、b、c). 在 2 dpi 或 8 dpi 时，在 BW746 或 Bowman 的吸器感染的叶肉细胞中未观察到自体荧光细胞死亡。然而，受感染的 BW746 叶肉细胞在 4 dpi 时表现出强烈的台盼蓝染色，表明细胞膜通透性发生明显变化，这表明响应真菌攻击的细胞活力丧失，而受感染的 cv细胞. Bowman 显示膜渗透性没有变化。BW746 还与感染部位周围的褪绿晕圈和未能形成管道有关。1 _Bowman 与 BW746 杂交的植物对 BW746（抗性）和 Bowman（易感）的植物表现出中间反应，表明Rph3表达的不完全优势。

图 1：大麦柄锈菌在 cv. 叶子中的发育。

Bowman ( rph3 ) 与其近等基因系 BW746 ( Rph3 ) 的比较。

a受感染的 cv 叶片片段。Bowman（上）和 BW746（下）在 2、4 和 8 dpi 下。这些照片是在整个时间点从相同的叶子拍摄的。

b cv 的叶肉细胞的 WGA-FITC 染色真菌定植的显微可视化。Bowman 和 BW746 以 2、4 和 8 dpi 离开。

3.2 基于图谱的Rph3克隆

来自 cv. 之间杂交的 182 个重组近交系 (RIL) 群体。rph3 用于研究包含Rph3 的染色体区域。整个群体的基因分型与先前报道的标记在染色体臂 7HL 40的Rph3基因座附近。可调谐基因分型测序 (tGBS) 被用于 42 个具有代表性的 RILs，这些 RILs 来自抗性和易感表型类别（每个 21 个品系），在Rph3基因附近携带重组染色体，抗性和易感性群体各来自 10 个品系，以及父母。这确定了 24 个与Rph3轨迹并根据参考 cv 在 4.7 Mb 的物理窗口中将其定界。选择几个均匀分布在该窗口内的注释高置信度基因来设计标记以丰富Rph3的遗传图谱。在用侧翼标记 MLOC_005 和 MLOC_040筛选来自六个群体的 10,411 个 F 2 个体 后，确定了367 个重组事件。重组家族的表型将Rph3 基因座划定为 0.22-cM 间隔，两侧是标记 MLOC_004 和 MLOC_023，它们之间有 45 个重组事件。在该区域开发的九个额外标记基于参考基因组将Rph3基因座映射到标记 MLOC_190 和 MLOC_389 之间的 0.02-cM 间隔，分别有两个和三个重组体到Rph3基因座（图 2). MLOC_389 和Rph3之间的三个重组体通过测序得到证实。Rph3基因的物理定界在 cv 中进行。

Barke 已被证明携带抗性基因基于本研究中的多病原体测试 和基因组序列草图的可用性。根据 cv，Rph3基因座位于 8,519 bp 的物理窗口中。Rph3基因组序列．这个 8.5 kb 的窗口在来自六个Rph3作图群体和 cv 的所有抗性亲本中被重新测序。Barke 通过 Sanger 测序证明了一个相同的 8.5 kb 序列，在所有七个抗性品系中没有任何多态性。根据 cv 的参考基因组注释，该区域内没有注释基因。使用 FGENESH 软件确定了两个开放阅读框，指定为ORF1和ORF2（图 2），预计分别编码 101 和 276 个氨基酸的蛋白质。

图2：大麦叶锈病抗性基因Rph3的图位克隆。

基于 10,411 F 2个体之间的分离构建了Rph3基因座的高分辨率遗传连锁和物理图谱。在侧翼标记 MLOC_004 和 MLOC_023 之间发现了 45 个重组体。Rph 3 基因物理上位于基于 cv 的 8519 bp 间隔内。巴克参考序列。在窗口内识别的两个推定基因显示为ORF1和ORF2。ORF2编码序列中的四个独立的 EMS 诱导突变体表明ORF2是Rph3抗性所必需的。

3.3Rph3介导的抗性功能丧失的正向遗传筛选

为了确定抗性是否需要ORF1和/或ORF2 ，使用两个抗性品系 BW746 和 cv. 生产了两个甲磺酸乙酯 (EMS) 诱变种群。在用Rph3 -无毒致病型 5453 P- 筛选的 850 M 2中鉴定出六个改变的表型突变体家族。对 8.5 kb Rph3区域（包括六个纯合突变体中的ORF1和ORF2）进行重测序，揭示了四个品系在ORF2中具有单核苷酸变化. 其余两条在基因座内没有变化的品系与四种已知突变体不等位。对具有Rph3毒性致病型的 ORF2序列改变的四个突变体的M 3种群的表型筛选证实 M198 和 M466 完全易感，而 M167 和 M181 显示中间反应（图2 ). 由于在第 72 位形成新的终止密码子，突变系 M198 编码截短的蛋白质，而突变系 M466 在剪接点后第一个内含子的第五个核苷酸处发生核苷酸变化。突变系 M466 没有存活，并且无法检查 RPH3 蛋白的蛋白质结构变化。在其他两个突变体中，M181 具有 L93 > F 氨基酸取代，M167 具有 P126 > L 取代。由Rph3无毒致病型形成的 夏孢子对这些后一种突变体的纯合植物明显大于抗性亲本上形成的 夏孢子. 这些突变表型与分子水平的变化一致：涉及早期终止密码子 (M198) 和预测的剪接变体 (M466) 的蛋白质结构改变导致完全易感反应。相反，单个氨基酸替换（M167 和 M181）导致中间反应。所有这些独立的点突变都发生在ORF2中，并且在六个改变的表型突变体中的任何一个中都没有在ORF1或基因间区域（8.5 kb 物理窗口）中检测到变化。这些结果表明，ORF2是Rph3介导的抗性所必需的。

3.4 Rph3的转基因互补

为确定ORF2是否足以补充Rph3的缺乏以抵抗P. hordei ，我们使用由其天然启动子驱动的ORF2的完整基因组编码序列进行了互补测试。RNA-seq 的拼接比对显示ORF2由 831 bp 编码序列和 254 bp 5'-、292 bp 3'- 非翻译区 (UTR) 组成。一个 7196 bp 的 DNA 片段，包含ORF2的整个转录区域，包括抗性 cv 的天然启动子（3146 bp 上游区域）。Barke转化为易感大麦品种。基于在选择条件下产生的总共 20 株植物的 16 株初级 (T 0 ) 转基因植物中选择标记基因的 PCR 扩增，明确检测到 T-DNA 构建体。基于检测 Rph3 抗性等位基因的特异性标记，T 1 代转基因的存在与对 Rph3 无毒致病型的抗性反应共分离。该遗传转化实验证明ORF2弥补了Rph3的缺失在简历中。总之，高分辨率和物理定界、四个独立的突变体和转基因互补结果提供了ORF2是Rph3的一致证据。

3.5 Rph3由对Rph3无毒的P. hordei分离株诱导

在任何已发表的大麦 RNA-seq、全长 cDNA 或表达序列标签 (EST) 数据库中均未发现Rph3转录本。通过 RT-qPCR 在接种了对Rph3无毒的P. hordei致病型的抗性品系 BW746 的叶子中检测到Rph3 的转录物（图3）。相比之下，在接种Rph3强毒致病型或模拟接种的叶子中未检测到转录本，这意味着Rph3仅在不相容的相互作用期间被诱导。当用两种不同的Rph3攻击时，在 BW746 的植物中检测到Rph3转录物- 无毒致病型（200 P- 和 5453 P+），但接种两种不同的Rph3 - 有毒致病型（5457 P+ 和 5656 P+）时则不然。在接种小麦叶锈病病原体P. triticina（致病型 26-0 和 104-1,2,3,(6),(7),11,13）时也未检测到转录本。这些结果表明，Rph3的表达明确地由Rph3无毒大麦芽孢杆菌致病型感染诱导（图 3）。此外，仅在受感染的组织中检测到 Rph3表达，表明信号无法传输到同一植物的未受感染部分。转基因家族的检查表明， Rph3转基因在 T 1分离后代中的表达谱与诊断性Rph3标记检测到的转基因的存在/不存在很好地对齐。转基因植物中的外源Rph3表达水平比cv 中的Rph3等位基因强得多。当受到Rph3无毒致病型挑战时的 Estate，这可能是由于转基因的拷贝数或插入基因附近的转录增强元件。未检测到任何Rph3的表达无论使用何种锈病病原体，感染期间易感单倍型（cv. Morex）的同源物。同样，在任何处理中都未检测到推定的ORF1的转录本。综上所述，这些实验表明，当受到 Rph3 无毒大麦芽孢杆菌致病型的攻击时，Rph3 在携带 Rph3抗性等位基因的大麦基因型中明确表达，并且该基因的上调仅发生在受感染的组织中。

图 3：在 2–12 dpi 期间通过 RT-qPCR 检测到的Rph3转录水平，以响应有毒和无毒的致病型。

当叶子被Rph3无毒力的P. hordei病原体感染时， Rph3基因被上调（绿点 = 200 P-，绿色方块 = 5453 P+），而当叶子被Rph3有毒的病原体感染时，转录水平没有变化（黄色十字 = 5656 P+，黄色星号 = 5457 P+) 和P. triticina（蓝色菱形 = 26-0，蓝色三角形 = 104-1,2,3,(6),(7),11,13）。未接种幼苗（模拟接种）中Rph3的转录水平以黑线显示。值表示平均值±SE（显示为误差线）（n = 3). 在两个 dpi 下接种致病型 5453 P+ 的样品用作校准，以使用 RQ = 2 −ΔΔCq 的 delta-delta 方法计算相对定量 (RQ)值。ADP-核糖基化因子基因用作标准化剂。

3.6 Rph3在烟草中诱导细胞死亡

Rph3在相应的无毒基因存在时表达，但在缺乏无毒力时明显缺乏表达，这让人联想到执行基因对黄单胞菌属的抗性。由Bs3 54、Xa10 55、Xa23 56、Xa27 57和Bs4C 58等基因赋予。我们在本氏烟草中进行了Rph3的异源表达，发现它在MasΩ启动子下瞬时表达时会导致细胞死亡（图 4）。这种细胞死亡表型与细胞死亡相当由Xa10 55、Xa23 56和Bs4C 58的过表达诱导的本氏烟草。以前， Xa27的异源表达未显示导致本氏烟草中的细胞死亡。我们发现这种细胞死亡的缺失可能取决于表达水平，因为MasΩ启动子足以在本氏烟草中用于Xa27介导的细胞死亡（图 4a）。rph3的表达从功能缺失突变筛选中鉴定的等位基因表明，早期截断突变体 M198 (E72*) 不会导致细胞死亡，而非同义突变体 M167 (L93F) 和 M181 (P126L) 会导致本塞姆氏烟草中的细胞死亡（图 4b）。该结果与突变体的定量表型分析结果相匹配，其中突变体 M198 (E72*) 对显示完全易感性的反应具有最显着的影响，而突变体 L93F 和 P126L 部分功能丧失，抗性水平降低。

图 4：Rph3在本氏烟草中诱导细胞死亡。

a执行者抗性基因（Xa10、Xa27、Xa23和Bs4C）和Rph3（C 端 HA 标记）的瞬时表达在mas 启动子下诱导本塞姆氏烟草中的细胞死亡。

b非同义Rph3突变体 M167 (L93F) 和 M181 (P126L) 保留了在本氏烟草中引起细胞死亡的能力，而截短突变体 M198 (E72*) 则没有。Xa23和Xa27用作诱导细胞死亡的对照。

3.9 Rph3等位基因变异

易感大麦品种中位于 MLOC_190 和 MLOC_389 之间的Rph3区域。与抗性 cv 中的 8519 bp 相比，Morex 包含 98,478 bp 的物理间隔。Barke（补充图 17a、b）。在 cv 中发现了Rph3基因的四个同源序列。Morex（补充图 17c）。所有四种Rph3同系物都编码功能未知的蛋白质。CV中Rph3启动子区域的分析。与 cv 相比，用于转化的Barke（Rph3等位基因）。莫雷克斯 ( rph3等位基因；HORVU.MOREX.r3.7HG0741050) 揭示了 81.7% (2598/3179) 的序列同一性。推定的转录因子结合位点的映射确定了 Barke 和 Morex 单倍型之间推定位点的显着差异（补充图 18）。Rph3基因对 cv 的整个基因组的 BLASTN 。Barke 在 barke_contig_512435，即Rph3基因中发现了一个命中。基于 cv 的参考基因组序列草案的 PCR 引物对。Barke 59旨在扩增Rph3的完整编码和内含子序列。这些引物被应用于 78 个大麦种质的集合，包括 41 个带有 Rph3 和 37 个不带Rph3的品系并代表所有已知的Rph3等位基因，包括Rph3.c、Rph3.aa和Rph3.w 60。假定携带Rph3基因的所有 41 个品系均为 PCR 阳性，假定没有Rph3 的所有 37 个品系对于设计的引物均为 PCR 阴性。对 41 个 PCR 阳性的重新测序表明，整个 DNA 序列在所有抗性种质中是相同的。这一发现表明Rph3在栽培大麦中的单系起源。携带Rph3的三个不同假设等位基因的三个 Bowman NIL对致病型 5453 P+（对Rph3无毒）的反应) 的P. hordei是相同的。因此，我们得出结论，所有这些种群都起源于同一祖先，并转录了一种独特的Rph3亚型。

使用包含 20,607 个种质的全球大麦收集品对 GBS 标记进行分析，确定了落在Rph3基因上的单个成对 GBS 标记。这对 GBS 标记（gRph3_I1E2 和 gRph3_E2I2；补充表 8）在 134 个种质中检测到，包括 32 个地方品种、70 个品种、14 个育种系、15 个野生种质、1 个半野生种质和两个其他基因型（补充数据 7 ）。Rph3的地方品种和育种系来自世界许多地方，但品种主要来自欧洲（尤其是德国，有 27 个种质）。野生种质收集于以色列（9 种种质）、叙利亚（8 种种质）、约旦（2 种种质）、希腊（2 种种质）或来源不明（4 种种质）61. 用这种方法鉴定的单倍型具有相同的 GBS 标记序列。该 GBS 标记应用于 314 野生大麦多样性收集 (WBDC) 种群，并鉴定了 10 个携带Rph3的种质（补充数据 8）62。同时，基于Rph3基因序列的显性标记（MLOC_400，补充数据 2 ）证实了在所有 10 个携带 GBS 标记的种质中都存在显性Rph3等位基因，并鉴定了另外五个种质（WBDC044、WBDC094、WBDC238、WBDC254 和 WBDC260 ) (补充数据 8). 先前未在 k-mer 分析中识别的五个 WBDC 种质的 GBS 标记序列比对发现与Rph3相关的八到九个 SNP 。另外三个单倍型被确定为 Hap2：WBDC094 和 WBDC254；Hap3：WBDC238 和 WBDC260；和 Hap4：WBDC044。尽管诊断标记 MLOC_400 是阳性的，但在 WBDC044 和 WBDC094 中扩增完整Rph3等位基因的尝试未成功（补充图 20），这可能是由于引物结合位点的核苷酸变异。未来研究中的全基因组测序将需要进一步剖析基因座。野生大麦中多个序列变异的鉴定表明Rph3的其他等位基因变异可能存在。这些发现还表明，Rph3基因可能起源于以色列、叙利亚、约旦或希腊的野生大麦，并从这些地方渗入到栽培大麦种质中。

04

结论

在这里，我们使用基于图谱的克隆、诱变和转基因互补确定了Rph3介导的大麦青霉抗性的潜在基因。当植物受到无毒致病型攻击时，该基因专门表达，并且Rph3的表达触发大麦和本塞姆氏烟草中的细胞死亡。Rph3 _基因编码一个 276 个氨基酸的小蛋白，具有多个预测的跨膜螺旋，并且不包含迄今为止已知的任何抗性基因蛋白家族的保守结构域。编码的 RPH3 蛋白的表达谱和结构特征让人联想到 TALE 激活的执行者抗性基因。然而，迄今为止已报道的执行基因与水稻和辣椒的细菌病害抗性有关。

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原文获取

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-29840-1#Sec13

PDF获取：

https://www.scientsgene.com/h-nd-175.html

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